Работы учащихся - Хроматография

Главная >> Гимназисты >> Работы учащихся >> Химия >> Хроматография

Разделение пигментов с использованием метода хроматографии

Ситников Глеб (9 класс)

[+ презентация PPT (320 Kb)]

Хроматография - метод разделения сложных смесей, основанный на избирательной сорбции компонентов различными сорбентами. Он был впервые предложен русским физиологом и биохимиком растений М.С.Цветом.

Адсорбция - это поглощение растворенных или газообразных веществ поверхностью твердого тела или жидкости. Абсорбция - поглощение веществ жидкостями или твёрдыми телами. В отличие от адсорбции поглощение веществ происходит во всем объёме поглотителя. Адсорбция является обратимым процессом. В системе существует равновесие между явлениями поглощения вещества поверхностью (адсорбция) и явлением выделения вещества с поверхности (десорбция).

Во время пропускания разделяемой смеси через стеклянную трубку (колоночная хроматография), вследствие различной адсорбируемости и скорости передвижения различных веществ, компоненты смеси удерживаются на различной высоте столба адсорбента в виде отдельных зон. Вещества, обладающие большей способностью адсорбироваться, поглощаются в верхней части адсорбционной колонки, хуже адсорбируемые располагаются ниже. Вещества, не способные адсорбироваться данным адсорбентом, проходят через колонку, не задерживаясь.

По мере прохождения через слой адсорбента новых порций раствора хорошо адсорбируемые вещества продолжают удерживаться в верхней части колонки, а вещества, адсорбируемые слабее, вытесняются с поверхности адсорбента в нижние слои. В результате на столбике адсорбента получается несколько зон, образующие хроматограмму.

Образование хроматограмм происходит не только в результате адсорбции, но и вследствие других физико-химических явлений, в частности, сил сцепления на поверхности твердого вещества.

Силы сцепления

Различают основные пять методов хроматографического анализа:

1. Адсорбционный
2. Распределительный
3. Ионообменный
4. Осадочный
5. Эксклюзионный

I. Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции отдельных компонентов анализируемой смеси соответствующими адсорбентами. При работе этим методом анализируемый раствор пропускают через колонку, заполненную мелкими зернами адсорбента. Применяют адсорбционную хроматографию для разделения неэлектролитов, паров и газов.

II. Распределительная хроматография основана на использовании различия коэффициентов сорбируемости отдельных компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающимися жидкостями. Одна из жидкостей (неподвижная) находится в порах пористого вещества (носителя), а вторая (подвижная) представляет собой другой растворитель, не смешивающийся с первым. Этот растворитель пропускают через колонку с небольшой скоростью. Различные величины коэффициентов распределения обеспечивают неодинаковую скорость движения и разделения компонентов смеси. Коэффициент распределения вещества между двумя несмешивающимися растворителями есть отношение концентрации вещества в подвижном растворителе к концентрации того же вещества в неподвижном растворителе: (К = С_подв/С_неподв).

Иногда в качестве носителя для неподвижного растворителя вместо колонки используют полоски или листы фильтровальной бумаги, не содержащей минеральных примесей. В этом случае каплю испытуемого раствора наносят на край полоски бумаги, которую подвешивают в закрытой камере, опустив ее край с нанесенной на нее каплей испытуемого раствора в сосуд подвижным растворителем (движителем), который, перемещаясь по бумаге, смачивает ее. При этом каждое содержащееся в анализируемой смеси вещество перемещается с присущей ему скоростью в том же направлении, что и движитель. Такой вид распределительной хроматографии называют бумажной хроматографией.

Особым видом распределительной хроматографии является газожидкостная хроматография (ГЖК). В качестве неподвижной фазы используют различные нелетучие жидкости, нанесенные на инертный твердый носитель; в качестве подвижной фазы - газообразные азот, водород, гелий, двуокись углерода и др. Разделение смесей методом ГЖК осуществляется в колонках, представляющих собой трубки с внутренним диаметром 1 - 6 мм и длиной 1 - 5 м, заполненные инертным носителем, например диатомитом, пропитанным нелетучей жидкостью, или стальные и стеклянные капилляры диаметром 0,2 - 0,3 мм и длиной 25 - 100 м с жидкой фазой, нанесенной на стенки этих капилляров (капиллярная газожидкостная хроматография).

Так как многие органические соединения, например биополимеры, перевести в газовую фазу затруднительно или вообще невозможно, то для таких веществ применяется жидкостная хроматография высокого давления (молекулярная жидкостная хроматография). В качестве неподвижной фазы применяются мелкопористые инертные носители, покрытые пленкой различных полимеров, нерастворимых в органических растворителях. Заполнение колонок (диаметром 0,5 - 50 мм) неподвижной фазой проводят под давлением в 150 - 300 атм., благодаря чему добиваются высокой однородности и плотности заполнения и, следовательно, эффективности разделения. Элюирование разделяемых веществ осуществляется пропусканием через колонку какого-либо подходящего органического растворителя или их смеси под давлением в 50 - 200 атм.

III. Ионообменная хроматография основана на использовании ионообменных процессов, протекающих между подвижными ионами адсорбента и ионами электролита при пропускании раствора анализируемого вещества через колонку, заполненную ионообменным веществом (ионитом). Иониты представляют собой нерастворимые неорганические и органические высокомолекулярные соединения, содержащие активные (ионогенные) группы. Подвижные ионы этих групп способны при контакте с растворами электролитов обмениваться на катионы или анионы растворенного вещества. В качестве ионитов применяют окись алюминия (для хроматографии), пермутин, сульфоуголь и разнообразные ионообменные вещества - ионообменные смолы. Иониты делят на катиониты, способные к катионному обмену (содержат активные группы: - SO₃H, - COOH, - OH); аниониты, способные к анионному обмену (активные группы: - NH₂, =NH); амфолиты – ионообменные вещества, обладающие амфотерными свойствами.

Фрагмент катионита: Катионный обмен: RH + KtAn = RKt + Han

Фрагмент анионита: Анионный обмен: ROH + HAn = RAn + H2O

IV. Осадочная хроматография основана на различной растворимости осадков, образуемых различными компонентами анализируемой смеси со специальными реактивами, нанесенными на высокодисперсное вещество. Анализируемые растворы пропускают через колонку, заполненную пористым веществом (носителем). Носитель пропитан реактивом-осадителем, который образует с ионами раствора осадки, имеющие различную растворимость. Образовавшиеся осадки в зависимости от растворимости располагаются в определенной последовательности по высоте колонки.

V. Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография основана на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гельпроникающую (ГПХ), в которой элюент – неводный растворитель, и гель-фильтрацию, где элюент – вода.

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты хроматографии: фронтальный, проявительный и вытеснительный. При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов. При проявительном варианте через слой сорбента непрерывно проходит поток элюента и периодически в слой сорбента вводится разделяемая смесь веществ. Через определённое время происходит деление исходной смеси на чистые вещества, располагающиеся отдельными зонами на сорбенте, между которыми находятся зоны элюента. При вытеснительном варианте в сорбент вводится разделяемая смесь, а затем поток газа-носителя, содержащего вытеснитель (элюент), при движении которого смесь через некоторый период времени разделится на зоны чистых веществ, между которыми окажутся зоны их смеси.

Преимущество хроматографического метода анализа состоит в том, что в ряде случаев он применим тогда, когда другие методы разделения смеси оказываются непригодными. При помощи этого метода можно разделить малые количества веществ с очень близкими химическими свойствами. Хроматографический метод прост в выполнении, и поэтому все более широко используется для разделения самых разнообразных смесей неорганических и органических веществ.

Используя различные методы, я решил проверить пигментный состав листьев различных растений, а так же провести ряд реакций, определяющий химические свойства хлорофилла. Для опытов я брал спиртовые вытяжки листьев высших растений, а также некоторые водоросли.

Разделение пигментов методом Крауса.

Убедиться в том, что в спиртовой вытяжке наряду с хлорофиллом присутствуют жёлтые пигменты, можно, используя их различную растворимость в спирте и бензине. Из пигментов группы каротиноидов в хлоропластах находится преимущественно жёлто-оранжевый каротин и золотисто-жёлтый ксантофилл. Все пигменты можно выделить из листа спиртом, но растворимость хлорофилла и каротина в бензине выше, чем в спирте. Ксантофилл в бензине не растворяется.

Методика проведения опыта:

В пробирку я налил 2 - 3 мл вытяжки, столько же бензина и 1 - 2 капли воды. Закрыв пальцем пробирку, взболтал в течение 2 - 3 мин. Через некоторое время жидкость разделилась на 2 слоя: бензин, как более легкий, оказался наверху, спирт – внизу. Оба слоя приобрели различную окраску: бензиновый - зеленую, спиртовой – жёлтую. Жёлтый цвет спиртовому раствору придает пигмент ксантофилл. В бензиновом слое находятся 2 пигмента: хлорофилл и каротин, который не заметен из-за интенсивно-зеленого цвета хлорофилла.

Действие щелочи на хлорофилл.

По химическому составу хлорофилл представляет сложный эфир дикарбоновой кислоты хлорофиллина. Хлорофиллин представляет собой азотосодержащее металлоорганическое соединение, относящееся к магний-порфиринам. В центре молекуле хлорофилла расположен атом магния, который соединён с четырьмя азотами пиррольных группировок. В пиррольных группировках хлорофилла имеется система чередующихся двойных и простых связей. Это и есть хромофорная группа хлорофилла, обуславливающая его окраску.

При взаимодействии сложных эфиров со щелочами (реакция омыления) происходит разрыв сложноэфирных связей с образованием соли данной кислоты и спиртов. В результате реакции омыления образуется соль хлорофиллина и 2 спирта: метиловый и фитол.

Методика выполнения эксперимента:

Налил в пробирку 2 - 3 мл спиртовой вытяжки пигментов, добавил 4 - 5 капель 20%-ного раствора щелочи и взболтал смесь. Произошла реакция взаимодействия хлорофилла со щелочью. Цвет раствора не изменился, так как соли хлорофиллина имеют зеленую окраску. Затем я добавил бензин, чтобы общий объем жидкости в пробирке увеличился в 2 раза, взболтал и дал отстояться.

Нижний спиртовой слой окрасился в зеленый цвет благодаря присутствию в нём натриевой соли хлорофиллина, которая, в отличие от хлорофилла, в бензине не растворима. Здесь же, в спиртовом слое, находился пигмент ксантофилл, но его окраска маскируется интенсивно зелёным цветом натриевой соли хлорофиллина. Верхний слой бензина окрашен в жёлтый цвет пигментом каротином.

Опыты по разделению пигментов спиртовой вытяжки листа показывают, что она содержит два жёлтых пигмента: каротин и ксантофилл. Количественное соотношение их в растениях примерно равное.

Химические свойства хлорофилла

Наличие магния можно легко обнаружить. Для этого надо подействовать на спиртовую вытяжку хлорофилла слабым раствором соляной или какой-либо другой кислоты. При этом произойдёт изменение окраски – вытяжка приобретает жёлто-бурый оттенок. Хлорофилл без магния получил название феофитина.

В молекуле феофитина сравнительно легко ввести обратно какой-нибудь металл и восстановить металлоорганическую связь. Для этого к раствору феофитина прибавляют ацетат меди или ацетат цинка и нагревают. Цинк или медь входят в молекулу хлорофилла, и вытяжка становится опять зелёного цвета.

Методика проведения эксперимента:

1. В пробирку со спиртовой вытяжкой хлорофилла я добавлял разбавленный раствор соляной кислоты (1:20) до изменения цвета спиртовой вытяжки (бурый оттенок). Образовался феофитин. (Спиртовая вытяжка – 5 мл, соляная кислота – 25 капель). Пробирку необходимо постоянно встряхивать.
2. К раствору феофитина, полученному в первом опыте добавил кристаллический ацетат цинка 0,1 г (избыток) и нагревал на водяной бане в течение 5 минут. Раствор приобрел опять зелёное окрашивание. Образовался хлорофилл.

Для комплексного изучения пигментов я использовал метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Он проще и нагляднее, чем вышеизложенные методы. Для выполнения опыта я вырезал полоску хроматографической бумаги и с помощью капилляра нанес микрокаплю спиртовой вытяжки листа фикуса. Затем поставил бумагу вертикально в стакан с движителем – толуол : ацетон = 4 : 1

За счёт капиллярных явлений граница движителя начала подниматься вверх, увлекая за собой смесь пигментов, которые благодаря различной адсорбции разделились отдельными пятнами. В результате получилась хроматограмма:

Выводы по работе:

Я проверил листья различных растений на содержание в них пигментов. В результате этого выяснил, что в листьях находятся хлорофилл А, хлорофилл Б, каротин А, каротин Б, ксантофилл, эритроциты и фикоэритрины. В следующих работах я планирую попытаться установить количественное соотношение этих пигментов в различных растениях.

[ Домой ] [ Наверх ]